細胞裂解與蛋白質定量

Solarbio提供的細胞裂解液：

本系列試劑隨同配送一支PMSF，請收到后-20℃保存。RIPA裂解液4℃保存，如發(fā)現(xiàn)有少量沉淀，可常溫放置半小時，沉淀可消失，不影響使用。

使用裂解液在提取核蛋白的同時，也會將基因組一并釋放出來，細胞量高時會造成細胞裂解液粘稠，此時可以直接加入蛋白上樣緩沖液，煮沸再離心，離心取上清直接上樣電泳；若想測定濃度，可入加少量SDS（1%），煮沸后離心測濃度。本系列蛋白提取試劑所提取的蛋白由于含有去污劑，所以不適合使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒，請選擇BCA法或者Lowry法檢測蛋白濃度。

       如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散粘稠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。

蛋白質定量：

蛋白含量測定是以標準蛋白作為對照，根據(jù)蛋白濃度不同，吸光值不同而達到定量的目的。有些方法是理解蛋白本身的吸光值（紫外光譜吸收法）來定量，但更多的是用染料對蛋白進行染色，利用染料與蛋白結合顯出與原染料及蛋白不同的吸光值來定量的。后一種方法應用更普遍。

蛋白定量方法的選擇，應該考慮到蛋白結構（標準品選擇）、蛋白溶液內(nèi)干擾物等因素的影響。

考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的大吸收峰的位置（lmax），由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認為，染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性好。由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差。去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）干擾此法的測定。  

BCA（bicinchoninic acid）是理想的蛋白質定量方法。該方法因快速靈敏、穩(wěn)定可靠，對不同種類蛋白質檢測的變異系數(shù)非常小而倍備受專業(yè)人士的青睞。該方法的原理是，在堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+，Cu+與BCA試劑形成紫色的絡合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標準曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。BCA法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學物質的影響。在組織細胞裂解實驗中，低濃度的去垢劑SDS，Triton X-100，Tween不影響檢測結果，但螯合劑（EDTA，EGTA）、還原劑（DTT，巰基乙醇）和脂類會對檢測結果有一定影響。實驗中，若發(fā)現(xiàn)樣品稀釋液或裂解液本身背景值較高，可試用Bradford法測定蛋白濃度。

Lowry法蛋白質測定法是靈敏的方法之一。過去此法是應用廣泛的一種方法，在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。 Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。這個測定法的優(yōu)點是靈敏度高，缺點是費時間較長，要控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質較多。