遺傳霉素又稱新霉素(geneticin, G418)，是一種氨基糖苷類抗生素，是細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染常用的抗性篩選試劑。

 

　　產(chǎn)品篩選

 

　　由于每種細(xì)胞對G418的敏感性不同，而且不同的廠家生產(chǎn)的相同濃度的G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的佳篩選濃度。具體如下：將細(xì)胞稀釋到1000個細(xì)胞/mL，在100ug/mL~1mg/mL的G418濃度范圍內(nèi)進(jìn)行篩選，選擇出在10~14天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的低G418濃度來進(jìn)行下一步的篩選試驗。

 

　　由于每種細(xì)胞對G418的敏感性不同，一般變動在100ug/ml～1000ug/ml范圍。在篩選之前，一定要確定細(xì)胞對這一批G418的佳篩選濃度。盡管如此，特性明確的細(xì)胞系G418的佳用量還是穩(wěn)定的?！斗肿涌寺　方o出了幾個常用細(xì)胞系所需G418的佳用量。

 

　　由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因為轉(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒，終導(dǎo)致篩選不出陽性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染24小時之后才開始加G418篩選。隨著細(xì)胞的代謝G418的濃度和活性都會下降，所以每3~5天都要更換一次含有G418的篩選液。這時藥物濃度可以降200ug/ml。

 

　　加藥篩選約6天左右，細(xì)胞會大量死亡，孔中只剩下的細(xì)胞。這時會出現(xiàn)兩個問題：1.死亡的細(xì)胞會裂解釋放出有害物質(zhì)，導(dǎo)致那些有neo表達(dá)的陽性細(xì)胞死亡，即非選擇性死亡。2.孔中細(xì)胞數(shù)目很少，細(xì)胞之間的信號會變得很弱，也會導(dǎo)致陽性細(xì)胞的狀態(tài)不佳甚死亡。這個時候需要一種特殊的培養(yǎng)液：假如你要轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞，在3T3細(xì)胞匯合度達(dá)到80%的時候，換液，培養(yǎng)過夜之后收集培養(yǎng)液，通過濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按1：1混合備用。再轉(zhuǎn)染后篩選過程中就可以應(yīng)用這種培養(yǎng)基。

 

　　為了盡量減少陰性克隆的死亡給陽性克隆造成的不利影響以及增加陽性克隆的得率，可以應(yīng)用套環(huán)法或刮除法結(jié)合有限稀釋法來篩選陽性克隆。加藥后，在高倍鏡下，陽性克隆和陰性克隆很容易辨認(rèn)，在陽性克隆下用記號筆做個標(biāo)記。然后刮除陰性克隆，消化陽性克隆后繼續(xù)篩選培養(yǎng)；或者用套環(huán)套住陽性克隆，在套環(huán)內(nèi)加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一個新的孔中培養(yǎng)。后再用有限稀釋法把陽性克隆在96孔板中篩選。

 

　　一般經(jīng)過4周左右的篩選，得到的陽性克隆都比較穩(wěn)定。但是外源基因如果沒有整合到基因組中的話，目的基因還是很容易丟失的。但是外源基因整合到基因組中的概率太小了，而且是隨機(jī)整合，會導(dǎo)致表達(dá)的目的蛋白的量產(chǎn)生很大差異。隨著培養(yǎng)時間的延續(xù)，那些丟失了外源基因的細(xì)胞和很少表達(dá)目的基因的細(xì)胞會占據(jù)優(yōu)勢，強(qiáng)表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞會越來越少。這樣再次篩選是*的。只有經(jīng)過2次以上的篩選之后才能找到那種我們想要的強(qiáng)分泌目的蛋白的，遺傳穩(wěn)定的細(xì)胞克隆。